Consideraciones para diferentes tipos de muestras#
Hay muchas opciones diferentes para los tipos de muestras a visualizar, y los avances en las técnicas de preparación de muestras y las modalidades de imagen nos permiten visualizar especímenes biológicos cada vez más diversos y complejos. Al igual que con muchos otros aspectos del diseño experimental, la selección del tipo de muestra conlleva compromisos. Las muestras que se pueden preparar y de las cuales se pueden obtener imágenes de manera simple tienden a ser pequeñas, delgadas y relativamente claras, como una monocapa de células cultivadas. Estas muestras tienen ventajas obvias y se pueden obtener imágenes con alta producción, pero no son adecuadas para todas las preguntas biológicas. A veces se necesita una muestra más gruesa, como un organoide, o tejido entero o seccionado, especialmente cuando la pregunta biológica involucra interacciones entre diferentes tipos de células. Considere cuidadosamente qué contexto biológico es apropiado para su pregunta y qué mediciones le gustaría poder realizar en última instancia. A continuación, resumimos algunos tipos de muestras comunes
🤔 ¿Cuáles son mis opciones?
Aquí presentamos algunas categorías principales para los tipos de muestra. Tenga en cuenta que no existen límites estrictos entre estas diferentes categorías (por ejemplo, tanto las células como los organoides se pueden cultivar en 3D, muchos de estos especímenes se pueden visualizar en vivo o después de `fijación”), pero en los siguientes párrafos se resumen algunas ventajas y desventajas generales.
Células cultivadas
Muchos tipos diferentes de células se pueden cultivar o hacer crecer en un plato de cultivo. Las células se pueden cultivar en un monocultivo, con un solo tipo de célula, o en un co-cultivo con varios tipos de células.
Ventajas
Las células cultivadas tienden a ser relativamente sencillas de obtener imágenes y, para muchas preguntas, se pueden obtener imágenes con microscopía de campo amplio (consulte Adquisición), que es más rápida y accesible que los métodos de microscopía confocal o de super-resolución. Además, los microscopios de alta producción integrados con la robótica pueden permitir la automatización de experimentos y la obtención de imágenes con células cultivadas.
Las células se pueden congelar, descongelar y cultivar mucho más rápido que trabajar con muestras más complejas como organoides u organismos completos, acortando el marco temporal para realizar un experimento.
Desventajas
La mayoría de las aplicaciones en microscopía requieren visualización a través de un cubreobjetos de vidrio de un grosor y tolerancia específicos. Sin embargo, muchos tipos de células no sobreviven o no pueden crecer en vidrio y requieren recubrimientos y manipulaciones adicionales del cubreobjetos para garantizar la salud de la muestra. Como alternativa, algunas empresas fabrican cámaras de imágenes (como placas de pocillos múltiples, platos de cultivo de 35 mm…) con polímeros patentados que tienen propiedades similares al vidrio (polímeros ópticos), lo que permite obtener imágenes de alta resolución. Es imperativo entender si el aceite de inmersión utilizado durante la formación de imágenes afecta la integridad de estos polímeros, ya que los solventes en algunos medios de inmersión pueden agrietar o disolver la capa de polímero.
Organoides
Los organoides son células que se cultivan en 3D para imitar la estructura y, a veces, las funciones de los órganos. Los organoides generalmente se cultivan a partir de células madre que se auto-organizan en una estructura más compleja, incluida la diferenciación en diferentes tipos de células. Los organoides son muy adecuados para preguntas sobre desarrollo, modelos de enfermedades y para comprender la regeneración de tejidos y órganos.
Ventajas
Debido a que los organoides contienen múltiples tipos de células y reflejan algunas estructuras y relaciones celulares observadas en los órganos in vivo, son adecuados para preguntas más complejas sobre enfermedades e interacciones célula-célula. También se pueden usar para modelar procesos y estructuras que son necesariamente 3D y no se recapitulan bien en una capa plana de células, como muchos procesos de desarrollo.
Los organoides pueden fabricarse a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de muestras humanas o animales y, por lo tanto, pueden modelar procesos de enfermedades específicos de un donante humano determinado.
Desventajas
Los organoides pueden requerir recursos y protocolos más complejos para crecer y pueden llevar más tiempo que simplemente cultivar células en vidrio o plástico.
Debido a que los organoides son estructuras 3D, a menudo no son aptos para imágenes de campo amplio y pueden requerir un disco giratorio o microscopía confocal de escaneo de puntos.
Tejido
Los tejidos se forman cuando las células actúan juntas para realizar una función específica. Los tejidos se pueden cultivar tomando un trozo de un animal o una planta y permitiéndole continuar sobreviviendo y creciendo en un plato de cultivo. Los tejidos también pueden recolectarse de plantas o animales y teñirse para detectar la presencia de diferentes moléculas. Los tejidos generalmente se cortan en pedazos (también conocido como seccionamiento de tejido), y se pueden fijar, frescos o congelados, o incluso vivos para la adquisición imágenes ex-vivo.
Ventajas
Los tejidos tienen interacciones célula-célula más intactas que generalmente son más representativas de lo que sucede in vivo que en el cultivo celular.
Los depósitos de tejidos humanos donados permiten que la investigación biomédica estudie diversas muestras de pacientes con una enfermedad particular.
Desventajas
Las células y los tejidos primarios tienden a ser más sensibles al medio ambiente que las líneas celulares inmortalizadas y pueden ser más difíciles de cultivar y pueden requerir protocolos especializados según el tipo de célula.
Los tejidos recolectados de un animal o planta completos requieren tiempo para el desarrollo y crecimiento de ese espécimen antes de la recolección.
Organismo completo/embrión
Algunos organismos completos son lo suficientemente delgados y transparentes como para generar imágenes. Algunos animales también tienen etapas embrionarias casi transparentes, como el pez cebra. Además, microscopía intravital permite la visualización de estructuras celulares o procesos biológicos dentro de un animal vivo en tiempo real, sin extraer los órganos ni fijar la muestra. En general, requiere instrumentación o modalidades específicas con una mejor penetración de la luz, como la microscopía multifotónica, y se limita por la capacidad de acceder al órgano específico, a menudo a través de ventanas ópticas.
Ventajas
La obtención de imágenes de organismos completos o embriones proporciona el contexto biológico más intacto posible al estudiar un proceso o estructura en particular.
Desventajas
La obtención de imágenes de muestras más gruesas puede requerir el procesamiento (transparentación del tejido) de la muestra para hacer que su índice de refracción coincida con el del medio externo y reduce la absorción y la dispersión de la luz.
Las microscopia intravital a menudo requiere técnicas quirúrgicas específicas y es supervisada por comités de bioética. Estas técnicas deben ser aprobadas por IACUC y/u otros comités institucionales.
⚠️ ¿Dónde pueden salir mal las cosas?
Fotoblanqueo y fototoxicidad - El fotoblanqueo se puede definir como la destrucción irreversible de un fluoróforo en su estado excitado, lo que significa que el fluoróforo no podrá emitir más luz y, por lo tanto, la señal de fluorescencia se degradará con el tiempo, lo que afectará el cociente señal-ruido y mediciones de intensidad. Para minimizar el fotoblanqueo durante la adquisición, hay varios agentes reactivos de fotoblanqueo que se pueden agregar a los medios. Estos agentes minimizan el fotoblanqueo de los fluoróforos en diferente medida y, por lo tanto, es importante ponerse en contacto con el fabricante para asegurarse de que sean óptimos para el fluoróforo específico. Por ejemplo, la adición de captadores de oxígeno a los medios de formación de imágenes, como la glucosa oxidasa o la piranosa 2-oxidasa, puede reducir significativamente el fotoblanqueo. Es importante comprender que el uso de {term}»captadores de oxígeno» puede afectar a las imágenes de células vivas, ya que estos captadores pueden afectar los niveles de ATP y oxígeno dentro de la muestra, comprometiendo su salud y, por lo tanto, su función biológica.
Las células se están muriendo - La luz fluorescente induce el daño del ADN y la oxidación de los componentes celulares (fototoxicidad). Además, el fotoblanqueo de fluoróforos puede inducir aún más la fototoxicidad al crear especies reactivas de oxígeno (ROS). La adición de antioxidantes y la eliminación de ciertas moléculas (ej., riboflavina) de los medios de montaje pueden reducir las ROS producidas durante la obtención de imágenes, lo que mejora la salud de la muestra.6
Mis células fijadas no tienen el aspecto esperado - La fijación puede cambiar la localización y la fluorescencia de diferentes proteínas. Siempre que sea posible, compare siempre la distribución de una proteína o molécula de interés con y sin fijación. Considere también si un método de fijación diferente puede ser más apropiado para su muestra.
Mi muestra es demasiado opaca: las muestras más gruesas, como secciones gruesas de tejido, células pigmentadas u organismos completos, pueden ser difíciles de visualizar debido a la absorción y dispersión de la luz inducidas por las faltas de homogeneidad en el índice de refracción dentro del tejido mismo, lo que resulta en una mala penetración de la luz. Para facilitar la obtención de imágenes de los tejidos, los investigadores a menudo cortan tejidos gruesos en secciones de diferentes grosores. Este proceso se llama corte de tejido. En la mayoría de los casos, las muestras se fijan y se incrustan en parafina o se congelan en un medio de congelación de tejidos y luego se cortan en secciones finas con una máquina como un criostato, un micrótomo o un vibratomo y las secciones se recogen en un tubo o en un porta-objetos. Alternativamente, la mayoría de los componentes en cualquier sistema biológico complejo, como un órgano, están fuera de este rango de volumen bidimensional y, por lo tanto, este enfoque compromete la comprensión de las relaciones espaciales entre los componentes celulares. La transparentación de tejidos se centró en reducir las faltas de homogeneidad en el tejido al equilibrar el índice de refracción en toda la muestra. Esto permite que la luz atraviese el tejido y, por lo tanto, permite obtener imágenes volumétricas de alta resolución de órganos y tejidos completos utilizando técnicas de microscopía convencionales, como la microscopía confocal, sin necesidad de seccionar físicamente la muestra.