Reproducibilidad

Una serie de factores son críticos en el diseño de un experimento de microscopía reproducible. Aquí se exponen algunos factores críticos; ver otros trabajos como ⁹

Validación de anticuerpos

Si bien en un mundo perfecto, los anticuerpos siempre serían específicos para un objetivo en particular, desafortunadamente, no siempre se puede confiar en esto al realizar inmunomarcación. ¹⁰ Cuando sea posible, se deben realizar controles de inactivación (knockout y/o knockdown) para confirmar la especificidad del anticuerpo. Cuando esto no sea posible, busque la disponibilidad de otro anticuerpo para una parte diferente de la molécula objetivo (a veces llamada epítopo) y confirme que obtiene una localización consistente.

La optimización de las condiciones de bloqueo y permeabilización para el anticuerpo y el protocolo en particular puede reducir el fondo no específico. También se deben realizar siempre controles sin anticuerpos primarios, ya que son esenciales para validar la especificidad de la señal.

Validación de localización de proteínas fluorescentes

La expresión de proteínas marcadas con fluorescencia puede hacer posible la localización de una molécula o estructura, especialmente cuando no existe un buen anticuerpo para el inmunomarcaje y/o será útil observar el comportamiento de la molécula en células vivas. Si bien un estudio que comparó la superposición entre los mismos objetivos moleculares con proteínas fluorescentes frente a anticuerpos encontró una superposición del 80 %, también encontraron que algunas consideraciones (como si el extremo C o N de una proteína está marcado) pueden causar cambios en la localización. ¹¹. Un artículo reciente ¹² examina las consideraciones para el marcado genético de moléculas para microscopía en vivo.

Bleedthrough

Al realizar microscopía de fluorescencia multicolor, es fundamental elegir fluoróforos con espectros de emisión y excitación suficientemente distintos. Las herramientas en línea como FPbase ¹³ pueden ayudar con tales selecciones, especialmente si conoce los diversos componentes ópticos del microscopio en los que obtendrá imágenes de sus muestras (estas configuraciones se pueden guardar y compartir en FPbase; pregunte el responsable del mantenimiento del microscopio que planea usar si dicho archivo de configuración ya está en línea). Incluso si cree que sus fluoróforos están lo suficientemente separados, es fundamental verificar los controles fluorescentes de un solo color utilizando las mismas condiciones de imagen (y preferiblemente el mismo día) que sus controles multicolores para asegurarse de que no se esté filtrando; es obligatorio hacer esto si planea medir colocalización.