Colocalización#

¿Qué es la colocalización?#

La colocalización es cuando dos o más marcajes diferentes (por ejemplo, eGFP y mCherry) se superponen espacialmente en su imagen (también llamado co-ocurrencia). Otro componente de la colocalización es que los marcajes fluorescentes a menudo se correlacionan en intensidad (es decir, los píxeles con eGFP más brillante también tienen mCherry más brillante). Es muy importante medir cuantitativamente la colocalización: ** ¡no confíe solo en sus ojos! **

También es importante reconocer que la co-ocurrencia no implica necesariamente interacción.

Grados de colocalización

Figura 6 La colocalización tiene que ver con la intensidad y la superposición espacial de los marcajes#


📏 ¿Cómo lo mido?

Hay dos ramas principales sobre cómo observar la colocalización: basada en objetos y basada en correlación.

  • La colocalización basada en objetos es adecuada cuando desea poder decir algo sobre una fracción de objetos que son positivos para varios marcajes (p. ej., el 99 % de las celdas eGFP+ también eran mCherry+). Aquí hay un flujo de trabajo de muestra:

flowchart LR A[Raw image Label #1] -->|Segmentation| B((Identified objects \n eGFP+ cells)) C[Raw image Label #2] --> |Segmentation| D((Identified objects \n mCherry+ cells)) B & D -->E(Measure overlap per cell \n if overlap > threshold %, say colocalized )--> G(Fraction of eGFP+ cells also mCherry+) E --> H(Fraction of mCherry+ cells also eGFP+) classDef empty width:0px,height:0px; style A fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style B fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style C fill:#FFF4d6,stroke:#FFBE0B style C fill:#FFD6E8,stroke:#F5006A style D fill:#FFD6E8,stroke:#F5006A

  • La colocalización basada en correlación es más apropiada cuando los marcadores que está midiendo no se encuentran en objetos discretos o cuando predice que la señal en los marcadores debería estar correlacionada. La colocalización basada en la correlación es más sencilla de medir, ya que no requiere ninguna segmentación de objetos. Los coeficientes de correlación de Pearson se pueden medir fácilmente en la mayoría de los softwares de análisis de imágenes (p. ej., FIJI, CellProfiler, etc.).

⚠️ ¿Dónde pueden salir mal las cosas?

  • No tener controles adecuados (p. ej., controles de marcaje único donde solo hay un marcador fluorescente presente). El ruido, la iluminación desigual y otros artefactos técnicos pueden causar correlación entre dos canales

  • No corregir el cambio entre canales Es común tener algún grado de cambio entre diferentes canales de imágenes debido a diferencias en la óptica (p. ej., diferentes cubos de filtro). No corregir este cambio (por ejemplo, midiéndolo y aplicando la corrección correspondiente a los canales) puede limitar su capacidad para detectar colocalización.

  • Bleedthrough A veces, la señal de un canal fluorescente se filtra a otro, lo que puede aumentar falsamente la colocalización detectada. Esto sucede más comúnmente con fluoróforos que tienen espectros similares (p. ej., GFP e YFP). Esto se debe a que el fluoróforo en un canal se excita débilmente por la luz utilizada para excitar un fluoróforo diferente y la fluorescencia emitida resultante atraviesa el filtro de emisión (por ejemplo, sus objetos verdes también aparecen en el canal amarillo). Evalúe esto con controles de un solo marcador.

  • Interpretación incorrecta de su métrica de colocalización Los detalles de la métrica elegida aquí son muy importantes: varían ampliamente en cuanto a la inclusión de píxeles de fondo, su sensibilidad al cociente señal-ruido, etc. Consultas con un experto, así como la inclusión de controles adecuados puede ayudarlo a estar seguro de que su medición es realmente lo que cree que es.

📚🤷‍♀️ ¿Dónde puedo obtener más información?