Decisiones de diseño experimental#
Al diseñar un experimento de bioimagenología cuantitativa se deben tomar una serie de decisiones críticas. Muchas de estas decisiones dependerán en gran medida de lo que sea posible dada la biología que desea estudiar, por ejemplo:
Siempre preferirá imágenes en vivo a imágenes fijas si es importante evaluar la dinámica de un proceso determinado
Es posible que deba realizar procesos especiales, como la transparentación del tejido, si es importante obtener imágenes profundas en una muestra relativamente opaca.
No puede confiar en el marcado genético con proteínas fluorescentes si su sistema modelo no es genéticamente manejable para tales manipulaciones.
Debe generar imágenes con una resolución particularmente alta para evaluar con confianza las interacciones entre dos moléculas fotografiadas en el mismo sistema.
Por lo tanto, es extremadamente importante pensar en todos los aspectos de su pregunta biológica antes de tomar una pipeta o un portaobjetos. Muchas decisiones de preparación de muestras están profundamente entrelazadas con la disponibilidad y la idoneidad de microscopios particulares; consulte [esa sección] (contenido/selección_de_microscopio) para obtener más información.
Montaje#
Cubreobjetos de vidrio#
Muchas aplicaciones de imágenes implican el montaje en cubreobjetos de vidrio, ya sea directamente o usando un cubreobjetos montado en un plato de cultivo. Si bien existe una amplia gama de tamaños y formas de cubreobjetos, el atributo más importante es el grosor del cubreobjetos. El grado del cubreobjetos dicta el espesor y la tolerancia esperados. Estos factores son importantes porque la mayoría de los fabricantes de microscopios asumen un grosor de cubreobjetos específico (0,17 mm) en el diseño de las lentes del objetivo para minimizar las aberraciones. Estas aberraciones tienden a afectar el brillo y la resolución axial, reduciendo el cociente señal/ruido, la nitidez y la resolución. La tolerancia del cubreobjetos (para minimizar la variabilidad de espesor) es fundamental para técnicas de superresolución o medidas de intensidad en imágenes adquiridas con objetivos de alta apertura numérica. Otras aplicaciones no requieren el montaje de muestras sobre vidrio o plástico, sino que la muestra y la lente del objetivo se sumergen en el mismo medio.
Grado |
Espesor nominal [mm] |
Rango de espesores [mm] |
|---|---|---|
#1.5 |
0.17 |
0,16 - 0,19 |
#1.5H |
0.17 |
0,165 - 0,175 |
Medios de montaje#
El índice de refracción en el que se coloca la muestra, así como el índice de refracción del vidrio y el medio entre el objetivo y la muestra son críticos para determinar la resolución alcanzable. Los medios de montaje {term} pueden tener otras propiedades ópticas y/o experimentales importantes; es importante utilizar los medios de montaje correctos para el experimento planificado.
Figura 3 Efectos de los medios de montaje sobre la tinción con varios fluoróforos. Adaptado de Jonkman J., Brown C.M., Wright G.D et al. Tutorial: orientación para la microscopía confocal cuantitativa. Nat Prot 15, (2020) 5#
Selección de fluoróforos#
Los fluoróforos son moléculas que pueden emitir luz tras la absorción de un fotón, normalmente de longitud de onda más corta. Los fluoróforos relevantes para la investigación biomédica pueden ser colorantes orgánicos de moléculas pequeñas (FITC, Alexa Fluor 488) que se unen a estructuras celulares específicas (p. ej., DAPI, MitoTracker), análogos fluorescentes de moléculas pequeñas (p. ej., faloidina, aminoácidos fluorescentes) o proteínas fluorescentes. A continuación se enumeran algunas de las propiedades importantes que se deben tener en cuenta al elegir fluoróforos:
Espectros de excitación/emisión de cada fluoróforo
Brillo (los tintes tienden a ser más brillantes que las proteínas)
Fotoestabilidad
Propensión a oligomerizar (en el caso de proteínas fluorescentes)
Fototoxicidad (cuando se toman imágenes en muestras vivas)
Comprender los fluoróforos, las especificaciones del microscopio (fuente de luz, filtros, detector) y los objetivos del análisis son fundamentales para seleccionar los fluoróforos apropiados para abordar una pregunta científica. Consulte la sección sobre [reproducibilidad] (contenido/reproducibilidad) para obtener más información.