Medidas de intensidad#
¿Qué son las medidas de intensidad?#
La intensidad se refiere al brillo de la señal para un marcador fluorescente. Usando medidas de intensidad, podemos inferir una cantidad relativa de fluoróforo o marcaje. Entonces, por ejemplo, si tiene una proteína marcada con un fluoróforo, puede medir la intensidad de ese fluoróforo para obtener una medida relativa de la cantidad de proteína presente en su muestra. Las medidas de intensidad son las siguientes (no exhaustivas) y se pueden medir dentro de una imagen, en un objeto como una célula, en subregiones de un objeto:
Intensidad media: la intensidad media en todos los píxeles
Intensidad integrada: la suma de las intensidades de píxeles, un indicador de la cantidad total de ese marcador en un objeto
Medidas de textura: la suavidad de las intensidades
📏 ¿Cómo lo mido?
La intensidad es relativamente sencilla de medir, pero puede ser bastante difícil de hacer correctamente (ver más abajo). Le recomendamos encarecidamente que se ponga en contacto con un experto en análisis de imágenes antes de proceder con este tipo de análisis porque hay muchos lugares donde las cosas pueden salir mal. En general, desea medir imágenes en bruto o imágenes corregidas por iluminación, pero en general con un procesamiento de imagen {term} mínimo. La corrección de iluminación es una forma de procesamiento de imágenes para compensar el patrón desigual de iluminación producido por la mayoría de las fuentes de luz donde el centro del campo de iluminación es más brillante que los bordes. Luego, las mediciones de intensidad se pueden realizar en cualquier software estándar de análisis de imágenes, ya sea en toda la imagen o en objetos identificados. Vea a continuación un flujo de trabajo de ejemplo:
⚠️ ¿Dónde pueden salir mal las cosas?
Saturación Los píxeles saturados son tan brillantes que sus valores de intensidad sobrepasan las capacidades de nuestro detector (cámara). Si tiene píxeles saturados en las celdas que está tratando de medir, realmente no puede realizar la mayoría de las mediciones de intensidad. Esto se debe a que, en el caso de los píxeles saturados, no sabe qué tan brillantes son en realidad, solo que son más brillantes de lo que puede detectar. Hay algunas medidas de intensidad que son robustas a cierta saturación. Por ejemplo, la intensidad mediana de una imagen no se verá afectada por la saturación a menos que tenga más de la mitad de la imagen saturada. Pero las mediciones como la intensidad media se verán afectadas por la saturación.
Controles inadecuados En la mayoría de los casos, las medidas de intensidad exactas que obtiene no significan nada biológicamente de forma aislada. Es solo mediante la comparación entre diferentes condiciones que podemos generar alguna percepción biológica. Por lo tanto, una condición de control es muy importante para compararla con su condición experimental.
No coinciden las condiciones de adquisición de imagen entre las condiciones experimentales Debido a que las medidas de intensidad se ven afectadas por el tiempo de exposición, la intensidad de la fuente de luz y otros factores, es muy importante hacer coincidir la configuración de imagen en todas las muestras. De manera relacionada, debe asegurarse de no separar las sesiones de microscopía de sus condiciones experimentales y de control en diferentes días si esto puede evitarse de alguna manera. Los fluoróforos pueden atenuarse con el tiempo en las muestras, lo que complica la interpretación si se tomaron imágenes de diferentes tipos de muestras en días diferentes.