Glosario

Bloqueo

Durante el procedimiento de inmunotinción, es importante minimizar la unión no específica de los anticuerpos primarios o secundarios. En la mayoría de los casos, esto se logra mediante el bloqueo, que generalmente implica agregar sustancias como sueros normales, gelatina o albúmina antes de la inmunotinción para «ocupar» todos los sitios de unión no específicos en la muestra.

Deconvolución

El proceso de eliminar computacionalmente el desenfoque de las imágenes de microscopía mediante el uso de las propiedades ópticas conocidas de la trayectoria de la luz para «reasignar» la intensidad del píxel lejos de donde golpeó la cámara y de regreso a la estructura que emitió la luz.

Imágenes ex-vivo

Se refiere a las imágenes realizadas en tejido animal vivo en un entorno controlable externo (p. ej., explante de tejido en una placa de Petri). Permite obtener imágenes de alta resolución de tejido vivo que, de otro modo, sería inaccesible dentro del animal. El tejido se mantiene vivo en el sistema de imágen a través de la perfusión de medios oxigenados (95 % de oxígeno y 5 % de CO2) con temperatura controlada mediante bombas peristálticas y microfluidos.

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Fijación

La fijación de una muestra se refiere a la estabilización de los componentes celulares/moleculares dentro de la muestra y, al mismo tiempo, se detiene cualquier función biológica en esa muestra. El fijador utilizado (p. ej., paraformaldehído, glutaraldehído, metanol), la concentración y las condiciones (p. ej., tampón, temperatura) determinan el grado de conservación de las estructuras celulares y/o moleculares dentro de una muestra, y debe optimizarse dependiendo de la muestra o estructura que se está visualizando.

Procesamiento de imágenes

Es una operación que se puede realizar sobre una imagen, dando como resultado otra imagen. Las operaciones de procesamiento de imágenes pueden ser simples (por ejemplo, cambiar el tamaño o rotar) o más avanzadas (por ejemplo, mejorar características particulares de una imagen como círculos o líneas).

Medios de inmersión

El medio de inmersión es el medio que llena el espacio entre la lente del objetivo y el cubreobjetos de vidrio o la muestra. Afecta la apertura numérica de la lente del objetivo \(NA=RI * sin(θ)\), lo que afecta la resolución lateral y axial. Es fundamental hacer coincidir el RI de los medios de inmersión con el de los medios de montaje para minimizar las aberraciones y mejorar la calidad de la imagen. Los medios de inmersión pueden ser aire, agua, aceite de silicona, glicerol o aceite.

Inmunomarcaje

El inmunomarcaje es una de las técnicas de marcaje más comunes para muestras fijas. Puede utilizar anticuerpos primarios conjugados con fluorescencia para detectar la proteína de interés o un marcaje en dos pasos con un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia. El marcaje primario-secundario tiende a dar como resultado una amplificación de la señal. El problema principal con el inmunomarcaje es el tamaño de los anticuerpos, que requieren una permeabilización extensa. Otra buena alternativa es usar nanocuerpos, que solo tienen la cadena pesada y son significativamente más pequeños que los anticuerpos normales.

Microscopía intravital

Se refiere a la obtención de imágenes de estructuras celulares o procesos biológicos dentro de un animal vivo en tiempo real, sin extraer los órganos ni fijar la muestra. En general, requiere instrumentación o modalidades específicas con una mejor penetración de la luz, como la microscopía multifotónica, y se limita a la capacidad de acceder al órgano específico, a menudo a través de ventanas ópticas. Las imágenes intravitales son supervisadas por comités de bioética y deben ser aprobadas por IACUC y/u otros comités institucionales.

Medios de montaje

Es la solución en la que se coloca (monta) la muestra. Su propósito es preservar la muestra, incluidos los fluoróforos que contiene, y mejorar la calidad de la imagen durante la adquisición, amortiguando el pH, igualando el índice de refracción en toda la muestra (idealmente igualándolo con el del vidrio) y minimizando el fotoblanqueo (según el medio). Los medios de montaje evitan que la muestra se seque, lo que permite un almacenamiento a largo plazo.

Detección de objetos

Es la técnica de procesamiento de imágenes para detectar objetos dentro de una imagen. No le daría una máscara de los objetos, pero podría darle un cuadro delimitador, o una posición x, y.

Captadores/eliminadores de oxígeno

El oxígeno tiende a inducir el fotoblanqueo de tintes orgánicos y otros fluoróforos. La adición de captadores/eliminadores de oxígeno a los medios de imagen, como la glucosa oxidasa o la piranosa 2-oxidasa, puede reducir significativamente el fotoblanqueo de los fluoróforos presentes en la muestra. Es importante entender que el uso de captadores/eliminadores de oxígeno puede afectar la obtención de imágenes de células vivas, ya que estos captadores/eliminadores pueden afectar los niveles de ATP y oxígeno dentro de la muestra, comprometiendo su salud y, por lo tanto, su función biológica.

Permeabilización

Para que los anticuerpos utilizados durante la inmunotinción u otros fluoróforos penetren y se unan a su antígeno dentro de una célula o tejido, la integridad de la membrana debe desafiarse (generando agujeros) con un detergente suave. El paso de permeabilización debe optimizarse cuidadosamente según el antígeno de interés, ya que puede provocar una pérdida de citoplasma o una degradación de la señal.

Índice de refracción

Es una medida de cómo viaja la luz a través de un medio específico. Es un valor importante cuando se calcula la apertura numérica de un objetivo. Idealmente, se debe minimizar una falta de coincidencia en el índice de refracción entre la muestra (medio de montaje), el cubreobjetos y el medio de inmersión para mejorar la calidad de la imagen. Vea una demostración interactiva del índice de refracción en MicroscopyU

ROI

Regiones de interés. Píxeles en su imagen que le interesan (por ejemplo, una región en el tejido, una célula, un tumor, etc.)

Segmentación

Método de dividir una imagen en múltiples partes o regiones. Hay tres tipos diferentes de segmentación.

• La segmentación semántica, donde todas las partes de una imagen son parte de una clase. Común en la biología celular será la detección de células y el fondo de una imagen.

• Segmentación de instancias, la segmentación se basa en objetos, no sólo detecta dónde están las células, sino que divide cada célula como un objeto separado.

• Segmentación Panóptica, se puede definir como una combinación de las dos anteriores, porque identifica el objeto pero también lo clasifica. Un ejemplo en biología podría ser detectar todas las células en una imagen y clasificarlas entre aquellas que se dividen y las que no.

Umbralización

La forma más fácil de segmentación de imágenes, divide la imagen en dos partes, el fondo y el primer plano (o señal). Crea una imagen binaria donde, por lo general, los píxeles de fondo cambiarían a un valor de 0 y los valores de los píxeles de primer plano serían 1.

Transparentación de tejidos

La obtención de imágenes por fluorescencia de todo el grosor de un trozo de tejido es muy complicada debido a la absorción y dispersión de la luz inducida por las faltas de homogeneidad en los índices de refracción dentro del propio tejido, lo que da como resultado una mala penetración de la luz. Además, la luz proveniente de diferentes partes de la muestra contribuye a la borrosidad de la fluorescencia, lo que reduce drásticamente el contraste y la resolución en cualquier plano. Como resultado, los investigadores tienden a utilizar técnicas de corte de tejidos para extraer información sobre los componentes celulares y su distribución espacial o relaciones a partir de un volumen bidimensional delgado. Sin embargo, la mayoría de los componentes de cualquier sistema biológico complejo, como un órgano, no están contenidos dentro de este volumen bidimensional y, por lo tanto, este enfoque compromete la comprensión de las relaciones espaciales entre los componentes celulares. La transparentación de tejidos se centró en reducir las faltas de homogeneidad en el tejido al equilibrar el índice de refracción en toda la muestra. Esto permite que la luz atraviese el tejido y, por lo tanto, permite obtener imágenes volumétricas de alta resolución de órganos y tejidos completos, utilizando técnicas de microscopía convencionales, como la microscopía confocal, sin necesidad de seccionar físicamente la muestra.

Seccionamiento de tejido

La penetración de la luz y las imágenes de fluorescencia se ven afectadas negativamente por la dispersión de la luz dentro de una muestra gruesa. Esta dispersión se debe a los diferentes índices de refracción presentes en un tejido. Para facilitar la obtención de imágenes de los tejidos, los investigadores a menudo cortan tejidos gruesos en secciones de diferentes grosores. Este proceso se llama corte de tejido. En la mayoría de los casos, las muestras se fijan y se incrustan en parafina o se congelan en un medio de congelación de tejidos y luego se cortan en secciones finas con una máquina como un criostato, un micrótomo o un vibratomo y las secciones se recogen en un tubo o en un portaobjetos.