Introducción#
Los microscopios son instrumentos ópticos y, como tales, están compuestos por diferentes componentes y dispositivos ópticos. Como principiante, es importante reconocer los parámetros experimentales que pueden afectar la calidad y el rigor de los datos de imagen y, por extensión, su interpretación.
Un concepto fundamental es el «trayecto de luz», que se puede utilizar para rastrear la trayectoria de la luz desde la fuente de luz hasta el detector. Cuando se trabaja con microscopios, ya sea un microscopio de cultivo celular o un sistema de superresolución de vanguardia, es importante tomarse el tiempo para rastrear las diferentes trayectorias de luz en el sistema. Al abordar el sistema como una suma de sus partes, la optimización y la resolución de problemas se convierten en procesos sistemáticos en comparación con cuando el sistema se trata como una caja negra. Este tutorial interactivo en MicroscopyU muestra las trayectorias de luz en un microscopio invertido estándar; [esta vista] (https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/components) brinda más detalles sobre las distintas partes.
Tipos de microscopios#
Si bien no es una lista completa de lo que está disponible, a continuación se enumeran algunos de los tipos de microscopios más comunes.
Microscopio de campo amplio, a veces llamados microscopios de epifluorescencia, captan toda la luz disponible en una sola trayectoria de luz; este enfoque requiere el hardware menos complejo y, a menudo, también es ventajoso cuando se toman imágenes de muestras tenues. {term}La «deconvolución» a veces se realiza después de obtener imágenes en un microscopio de campo amplio para eliminar la borrosidad.
Microscopio Confocal: microscopios que eliminan la luz desenfocada en la trayectoria de la luz, normalmente usando uno o varios “pinholes” (colimador de orificio delimitante) para bloquear físicamente esta luz. Existen varias variantes de microscopía confocal. Los microscopios confocales de disco giratorio a menudo se prefieren para aplicaciones de imágenes de células vivas, ya que tienden a minimizar la toxicidad de la muestra.
Los microscopios multifotónicos utilizan múltiples pulsos de luz de longitud de onda más larga (menor energía) para penetrar profundamente en el tejido, ya que es menos probable que los tejidos dispersen estas longitudes de onda. Una vez allí, múltiples fotones de baja energía que golpean el fluoróforo al mismo tiempo usarán su energía combinada para activar un fluoróforo. Cada fotón por sí solo sería demasiado débil para provocar esta activación. Debido a que el beneficio de estos sistemas está en su penetración más profunda, a menudo se usan para realizar imágenes de animales vivos.
Microscopios de superresolución que están diseñados para permitir al usuario eludir el límite mínimo de resolución óptica (típicamente 200 nm, dependiendo de la consideración de la muestra) para resolver estructuras muy pequeñas. A veces, esto se logra con hardware especializado (como en STED y SIM) y, a veces, con sondas especializadas (como en PALM y STORM).
Microscopios de hoja de luz que iluminan la muestra de forma perpendicular al eje de la imagen, a menudo mediante un segundo conjunto ortogonal de lentes objetivo. Esto permite el seccionamiento óptico delgado en grandes volúmenes, pero presenta más consideraciones sobre el montaje de la muestra. En los últimos años han surgido muchas variaciones de los microscopios de hoja de luz.
Importante
Independientemente del tipo de microscopio que utilice, los microscopios científicos son instrumentos complejos con muchas piezas de trabajo, todas las cuales normalmente deben estar en buen estado de funcionamiento y calibradas/alineadas correctamente para que se produzcan imágenes cuantitativas. El encargado del mantenimiento de su microscopio generalmente se asegurará de esto, pero hable con ellos regularmente sobre las preguntas que pueda tener y sobre cómo los cambios en la configuración del microscopio pueden afectar su capacidad para realizar ciertas mediciones con precisión. Su responsable de mantenimiento de microscopios puede estar manteniendo una gran cantidad de microscopios con una gran cantidad de usuarios independientes, por lo que si algo parece «extraño», ¡asegúrese de hablar con ellos antes de continuar!